Il decorso clinico dell’infezione da HIV-1 ha una notevole variabilità dovuto al fatto che i ceppi virali sono molto vari tra loro dai punti di vista genotipico e fenotipico.

L’eterogeneità che lo caratterizza è dovuta alla frequenza piuttosto significativa di errori di replicazione virale che il virus non gestisce in quanto non possiede sistemi di correzione di eventuali errori commessi dalla transcriptasi inversa retrovirale (RT).

Virus dell'HIV.
Virus dell’HIV.

Quando il virus dell’HIV si replica può produrre varianti genetiche che possono essere compatibili con la crescita e la sopravvivenza virale soprattutto in condizione di resistenza ai farmaci. Le normali terapie utilizzate si basano su farmaci anti-retrovirali che hanno lo scopo di ridurre la concentrazione di RNA dell’HIV-1 nel plasma limitandone i danni e la formazione di una serie di eventuali varianti resistenti ai farmaci.

La replicazione dell’HIV dipende da un enzima codificato dal virus chiamato Transcriptasi Inversa che ha la funzione di copiare il genoma dell’RNA virale a singolo filamento in un ibrido intermedio a doppio filamento da cui si genera una copia di DNA a doppio filamento. L’enzima commette almeno un errore ogni 10.000 basi copiate ad ogni trascrizione che provoca quindi un altissimo tasso di mutazione in vivo.
Ciò porta alla formazione di un ampio numero di varianti virali che in alcuni casi possono avere una sensibilità ridotta nei confronti di alcuni farmaci anti-retrovirali. Le infezioni comportate da un virus che ha sviluppato una farmacoresistenza possono essere presenti sia in pazienti che non sono mai stati sottoposti ad una terapia anti-retrovirale, a causa della trasmissione da un individuo precedentemente sottoposto a terapia oppure a causa di mutazioni che si sviluppano spontaneamente. Inoltre la farmacoresistenza è una condizione che si fa strada nei soggetti a cui viene somministrata la terapia anti-retrovirale per una questione di vantaggio selettivo: la popolazione di virus resistente ai farmaci predominerà rapidamente e facilmente sulla popolazione sensibile alla terapia.

Per evidenziare la farmacoresistenza di una popolazione virale in un individuo e permettere quindi un migliore monitoraggio e trattamento dell’infezione da HIV si procede con un test di genotipizzazione di alcune parti del genoma virale che consta di quattro fasi successive:

* trascrizione inversa dell’RNA bersaglio per generare cDNA attraverso l’amplificazione di una regione selezionata sfruttando una reazione di polimerizzazione a catena (RT-PCR);
* sequenziamento Sanger che permette di ottenere una mappa genetica delle regioni del gene pol selezionate;
* elettroforesi su gel di poliacrilammide  e rilevamento delle informazioni da parte di un sistema informatico specifico;
* analisi delle sequenze forward e reverse dal parte del personale formato e ottenimento di un report finale nel quale vengono segnalate le eventuali resistenze ai farmaci.

La prima fase permette di isolare e amplificare la regione del gene pol che codifica per la Transcriptasi Inversa e la Proteasi. Questi due enzimi sono indispensabili al virus durante la replicazione ed è quindi su questi che alcuni farmaci vanno ad agire per limitare la replicazione incontrollata del virus. La presenza di mutazioni significative su questi geni causa quindi una perdita di efficacia nella terapia che sfrutta questo principio.
I campioni di RNA, precedentemente estratti dal plasma di un campione di sangue intero prelevato dal paziente di interesse e conservato in EDTA, devono essere retrotrascritti  in un filamento di cDNA prima di essere amplificati. L’amplificazione avviene attraverso la metodica PCR che consiste nel sottoporre i campioni ad una serie di cicli a temperature differenti in grado di produrre, in presenza della corretta quantità di reagenti, un numero sempre maggiore di copie identiche al cDNA bersaglio. Durante ogni ciclo il DNA viene sottoposto a denaturazione della doppia elica che tende quindi ad aprirsi permettendo la successiva fase di anealing, in cui i primers si ibridizzano con il filamento stampo preparando la catena di DNA alla fase finale di allungamento in cui si ha la sintesi vera e propria del filamento de novo. Questa procedura permette di effettuare delle analisi utili a partire anche da una esigua quantità di DNA ottenuta dal campione di interesse.
E’ bene ricordare che durante questo processo non viene amplificato l’intero genoma del virus ma solo una parte del gene pol utile all’analisi. Questa selezione viene fatta attraverso l’utilizzo di primers specifici che permettono di identificare una specifica regione del gene.

Sequenziamento Sanger: utilizzo di primers marcati e ddNTPs.
Sequenziamento Sanger: utilizzo di primers marcati e ddNTPs.

Il sequenziamento Sanger consiste nell’identificare la sequenza corrispondente al gene analizzato simultaneamente in entrambi i filamenti del DNA precedentemente amplificato.
Per fare questo vengono preparate per ogni campione una serie di provette di reazione contenenti i primers forward e reverse rispettivamente marcati con un colorante fluorescente diverso tra loro e i reagenti necessari per la sintesi delle nuove catene di DNA complementari alla catena stampo secondo il principio di sintesi sfruttato nella metodica PCR. La reazione avviene infatti all’interno di un termociclatore che permette di sottoporre campioni e reagenti ad una serie di cicli a diverse temperature. Durante il processo i primers si ibridizzano con il DNA permettendo l’estensione delle catene.
La peculiarità del metodo Sanger consiste nell’utilizzo di dideossinucleosidi trifosfati (ddNTPs) di terminazione della catena mancanti di due gruppi –OH che impedendo il legame fosfodiesterico con le basi successive terminano la sintesi della catena di DNA nella quale si è inserito. L’analisi di ogni regione del gene è associata a quattro provette, una per ogni dideossinucleoside utilizzato ottenendo così per ogni paziente dodici provette totali: quattro provette in cui avverrà la reazione relativa alla regione che codifica per la proteasi, quattro per la regione che codifica per la trascrittasi inversa beginning e quattro per la trascrittasi inversa middle. La regione del gene che codifica per la trascrittasi inversa viene analizzata in doppio in quando la sequenza di interessa risulterebbe eccessivamente lunga.
L’utilizzo dei ddNTPs permette di ottenere una serie di filamenti di diversa lunghezza in base alla posizione in cui sono stati incorporati durante la sintesi.

Sequenziamento Sanger: grafico ottenuto dall'elaborazione dati successiva alla fase di elettroforesi.
Sequenziamento Sanger: esempio di grafico ottenuto dall’elaborazione dati successiva alla fase di elettroforesi.

La fase successiva di corsa elettroforetica permette la separazione, in base alla lunghezza dei filamenti ottenuti, su un gel di poliacrilammide. Una frazione di ciascuna reazione avvenuta nelle dodici provette di reazione viene caricata nei pozzetti del gel posto in verticale sullo strumento per elettroforesi. Il gel ha una concentrazione ottimale che permette la separazione dei frammenti di DNA precedentemente ottenuti in base alla loro lunghezza.
Nello strumento viene introdotta una soluzione tampone che mantiene il contatto con la parte superiore e inferiore del gel. L’applicazione di un campo elettrico ad alta tensione da parte dello strumento permette ai filamenti di DNA caricati negativamente di migrare verso il polo positivo del sistema elettroforetico.
Vicino al fondo del gel di poliacrilammide, un raggio laser eccita il colorante fluorescente legato ai filamenti di DNA che permette la rilevazione della lunghezza d’onda emessa dal colorante fluorescente. La misurazione della luce emessa viene poi raccolta da un sistema informatico che elabora i dati per i quattro dideossinucleosidi di terminazione della catena.

Infine il sistema informatico permette di combinare le sequenze forward e reverse analizzate. La sequenza così ottenuta viene confrontata alla sequenza dell’HIV di riferimento in modo da stabilire le mutazioni presenti, incluse quelle di resistenza ai farmaci. Una volta che il personale competente ha terminato la lettura della sequenza ed indicato le mutazioni, ottiene dal sistema informatico un report finale nel quale vengono indicate le mutazioni presenti e le mutazioni significativi ai fini della resistenza ai farmaci anti-retrovirali.

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