SHERLOCK: diagnostica ad alta precisione con Cas13a

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Una coalizione di scienziati del MIT e di Harvard ha sviluppato SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing), una nuova promettente piattaforma diagnostica basata sul sistema CRISPR-Cas13a.

Ottenere dei test ad alta sensibilità e precisione è una sfida attuale nella lotta contro numerose malattie infettive.

La recente epidemia di Zika virus ha riacceso l’interesse per diagnostiche che siano non solo affidabili, ma anche economiche e portatili. Il personale sanitario coinvolto potrebbe spesso trovarsi in condizioni proibitive, e il metodo diagnostico ideale dovrebbe richiedere bassissime spese, tempi brevi e facilità di utilizzo.

L’ostacolo maggiore in questo contesto è la concentrazione di elementi virali nei campioni da testare. Il livello di risoluzione necessario è sotto la femtomole, meno di un milionesimo di miliardesimo di mole: per individuare un acido nucleico virale a queste concentrazioni sono necessarie tecniche dispendiose e non sempre affidabili.

Ma il gruppo di ricerca guidato da Feng Zhang, pioniere della tecnologia CRISPR, sembra aver individuato un’alternativa dalle enormi potenzialità.

Una proteina detector ?

Forse avete già sentito parlare di CRISPR, la tecnologia che sta rivoluzionando il mondo della ricerca e promette di fornire nuove possibilità terapeutiche per diverse patologie. Questo elemento genico, originariamente scoperto in cellule batteriche, comprende una ricca squadra di proteine con diverse funzionalità.

Molte di queste rimangono da caratterizzare e il recente lavoro pubblicato su “Science” sfrutta proprio la proteina Cas13a (CRISPR Associated protein 13a).

Il motivo funzionale che accomuna questi sistemi è la capacità di riconoscere in maniera precisa acidi nucleici: Cas9, ormai celebre, può tagliare una sequenza di DNA bersaglio utilizzando una guida complementare composta da RNA.

Cas13a è invece una sconosciuta in questo gioco ed esibisce un’attività singolare che può essere sfruttata ingegnosamente.

Anche questa molecola lega un RNA che svolge il ruolo di guida, ma una volta riconosciuto l’acido nucleico bersaglio, accade qualcosa di differente. Cas13a inizia infatti a degradare in maniera non selettiva tutte le molecole di RNA che incontra.

Cas13a – Credits: Science pubb.

…bene, ma non parlavamo di test diagnostici?

Capire come sfruttare un meccanismo del genere richiede una certa lungimiranza.

I ricercatori del MIT sono riusciti a sfruttare questa attività naturale per individuare piccolissime concentrazioni virali. L’ingrediente mancante è RNA fluorescente “quenchato”.

Questo strano termine indica uno stato in cui la molecola fluorescente è schermata, e quindi non in grado di emettere segnale luminoso.
I filamenti di RNA interi non sono quindi individuabili, mentre una volta digerite le singole basi sono in grado di generare fluorescenza. A questo punto il meccanismo è quasi completo: è sufficiente introdurre Cas13a e l’appropriato RNA guida all’interno del campione, assieme a questo RNA reporter.

Se l’enzima individuerà il suo bersaglio, esso si attiverà e digerendo il reporter causerà fluorescenza. Il DNA del campione può essere precedentemente amplificato con semplici tecniche, e dev’essere trascritto a RNA perché il meccanismo funzioni.

Meccanismo d’azione del test – Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Gootenberg et al.

“Elementare, Watson”

Sembra complicato ed effettivamente lo è, ma nella pratica si svela incredibilmente efficace. SHERLOCK esibisce una precisione di un milione di volte maggiore rispetto ad un ELISA.
Ma non è tutto: la ricerca sottolinea anche come sia possibile ottenere una versione liofilizzata della reazione, che non necessiti di refrigerazione per la conservazione, che può essere realizzata su supporti solidi con l’aggiunta dei reagenti acquosi al momento dell’utilizzo. Si stima che un singolo test avrebbe il costo di soli 61 centesimi di dollaro.

Le possibili applicazioni vanno oltre l’individuazione di bassissimi titoli virali: Cas13a riesce a discriminare molecole che differiscono anche per un singolo nucleotide. Risulta quindi possibile individuare con precisione SNPs (single nucleotide polymorphisms), che risulterebbero molto importanti nello sviluppo di possibili biopsie su DNA circolanti.

Quello di cui possiamo essere certi è che molte altre proteine con attività potenzialmente interessanti rimangono da scoprire: la caccia al tesoro è appena cominciata.

 

Fonti| L’articolo originale , Il commento di Science