Un recente articolo apparso su Nature-light: science and application ha dimostrato, per la prima volta, come sia possibile studiare in maniera correlata le proprietà fisiche e chimiche di componenti cellulari in vitro senza processare o perturbare in alcun modo le cellule stesse e di come questo possa essere un marker tumorale di importanza clinica.
L’articolo in questione è nato dal lavoro congiunto tra i dipartimenti dell’Università di Perugia di Fisica e Geologia (dott. Sara Mattana, dott. Maurizio Mattarelli, Prof. Daniele Fioretto), di Chimica Biologia e Biotecnologie (dott. Lorena Urbanelli, dott. Krizia Sagini, Prof. Carla Emiliani), dell’Istituto Officina dei Materiali del CNR (dott. Silvia Caponi) e dell’Istituto di Biofisica del CNR di Trento (dott. Mauro Dalla Serra).
Il risultato spiega la dott.ssa Silvia Caponi del CNR di Perugia apre la strada, invero ancora molto lunga, su possibili nuovi fronti nella diagnostica citologica, non solo in laboratorio, ma anche in sala operatoria.
Introduzione
Una delle principali sfide in campo bio-chimico è la comprensione accurata e completa dei meccanismi che gestiscono la vita cellulare, cercando di correlare la struttura molecolare alla funzione da essa espletata, in maniera da ricreare una mappatura della dinamica della cellula stessa. Su tale scorta sono nati campi indipendenti della biologia, come la metabolomica, la proteomica, la genomica, ciascuno impegnato su un fronte diverso.
A dar man forte a tutto questo è subentrata la fisica, dalla quale sono stati presi in prestito alcuni concetti e metodiche che hanno permesso di facilitare il lungo e nebuloso lavoro di indagine.
La ricerca in oggetto è un altro esempio virtuoso di tale sinergia: questa volta è stata scomodata la microspettroscopia Raman e Brillouin che, basandosi su particolari tipi di interazione radiazione-materia, permette di studiare le caratteristiche elastiche (principalmente visco-elasticità e modulo elastico) e il tipo di legami chimici presenti in sezioni definite della cellula, con risultati importanti e di sicuro impatto futuro.
Il razionale fisico
Protagonista della ricerca è la versione home-made di un nuovo microscopio messo a punto nel laboratorio GHOST del dipartimento di Fisica e Geologia coordinato dal Professor Fioretto.
Il sistema sperimentale include uno spettrometro Raman e l’interferometro Brillouin, strumenti molto noti a chi si occupa di fisica dei materiali. Entrambi su basano sullo scattering (diffusione), in base al quale un’onda elettromagnetica subisce una deviazione dalla sua traiettoria nel momento in cui urta una particella. A seguito dell’interazione, l’onda può venir:
- assorbita;
- diffusa elasticamente (la frequenza dell’onda uscente è la stessa dell’incidente);
- diffusa anelasticamente (la frequenza dell’onda uscente è maggiore o minore di quella incidente).
Effetto Raman
L’effetto Raman riguarda proprio quest’ultima componente. La caratteristica altissima frequenza dell’onda uscente permette di capire il tipo di molecola, il suo orientamento e la natura dei legami chimici che la compongono, fornendo informazioni fondamentali.
Tra i vantaggi di questa tecnica vi sono:
- immediatezza;
- sensibilità;
- profondità di analisi;
- analisi chimica non invasiva e senza contatto.
Effetto Brillouin
In questo caso, a differenza della spettroscopia Raman, l’onda elettromagnetica viene diffusa anelasticamente non dalle vibrazioni della singola molecola ma da un fonone, ovvero una quasiparticella che descrive un quanto di vibrazione, cioè la più piccola ed indivisibile parte di una vibrazione, di un certo materiale omogeneo. A prescindere dalla caratterizzazione fisica, questo effetto è importante perché fornisce informazioni sull’elasticità e sulla viscosità del materiale, in questo caso costituito dalle varie componenti cellulari.
Il setting operativo
L’intera apparecchiatura è costituita da un laser a luce verde (λ=532nm) che viene convogliato, opportunamente filtrato, su un microscopio con focale capace di individuare con estrema precisione la zona interessante del campione. Il microscopio è, a sua volta, connesso con lo spettrometro e l’interferometro, i quali ricevono l’onda uscente dal materiale in esame e possono così analizzarne le componenti.
In questa specifica prova, resa possibile grazie alla collaborazione con il Laboratorio di Biochimica del Dipartimento di Chimica, Biologia e Biotecnologie coordinato dalla Prof.ssa Carla Emiliani sono stati utilizzati fibroblasti murini NIH/3T3 per la prova in vitro con cellule sane e una loro versione trasfettata con il vettore pcDNAtm6/myc-His per la contropare neoplastica.
Questa sequenza infatti codifica per una versione mutata del gene H-ras, che mantiene costitutivamente attivata la GTPasi, in maniera tale che la cellula sia stimolata a crescere, moltiplicarsi e metastatizzare.
Il microscopio è stato provato su tutta la superficie cellulare ed i dati che ha mostrato sono molto promettenti.
Risultati
Attraverso la spettroscopia Raman, i ricercatori sono riusciti a caratterizzare molecole presenti nelle varie zone della cellula.
A ciascun gruppo di molecole, siano esse DNA, lipidi o proteine, è stata assegnata una frequenza caratteristica dell’onda uscente, tutte osservabili nella banda intorno a 1650cm-1; andando a frequenze più alte, invece, sopra a 2950cm-1, è possibile valutare le varie molecole sulla base della ricchezza in gruppi metilenici e metile, più presenti nei lipidi e nelle proteine.
Spostandosi dalla membrana cellulare, abbondante in lipidi, al nucleo, dove sono meno presenti, si possono ottenere informazioni sulla composizione relativa delle singole zone cellulari, effettuando una sorta di “risonanza magnetica” della zona di interesse.
I risultati ottenuti dall’interferometro Brillouin hanno permesso di completare queste informazioni, potendo correlare le proprietà chimiche con quelle fisiche.
L’innovativa analisi dati realizzata dal Dottor Maurizio Mattarelli del NiPS Lab -Noise in Physical Systems- del Dipartimento di Fisica e Geologia, ha permesso di visualizzare la modulazione meccanica generata dalle strutture proteiche subcellulari all’interno delle singole cellule valutando opportunamente il contributo dell’acqua.
Dalle analisi è emerso, ad esempio, che il nucleo è una struttura piuttosto densa, nel quale il modulo elastico e la viscosità sono più elevate rispetto al resto dell’ambiente cellulare.
Confronto cellula sana-neoplastica
Nel fibroblasto sano, le analisi effettuate hanno mostrato un nucleo a carattere denso, cosa che non accade nel fibroblasto transfettato, nel quale la viscosità apparente e il modulo di elasticità sono assai ridotti, nella stessa zona. Ciò è giustificabile facendo riferimento alle modificazioni nell’espressione genica che la cellula subisce con il processo oncogenico, tutte atte a far assumere un’alta mobilità alla cellula in modo che possa deformarsi facilmente e migrare.
Conclusioni
Le possibili applicazioni di quello che allo stato attuale è un proof-of-concept sembrano essere molto promettenti: secondo i ricercatori, sarà possibile con questa tecnica non invasiva analizzare l’area di interesse con minimo stress per il paziente.
Dallo stesso gruppo di ricerca sono nati altri studi simili, che esplorano l’applicabilità nel campo dell’oculistica, nella fattispecie nella lotta al cheratocono e alla sua diagnosi precoce, nella neurologia, per lo studio rapido delle placche amiloidi nella demenza di Alzheimer.
Bisognerà attendere successivi sviluppi, sperando che altri centri di ricerca si dotino di apparecchiature del genere, essendo quelle perugine quasi uniche nel panorama mondiale.
FONTI | articolo Nature; comunicato stampa
APPROFONDIMENTI | articolo applicazione placche Alzheimer; articolo applicazione cornea
RINGRAZIAMENTI | Si ringraziano il Prof. Daniele Fioretto e la dottoressa Silvia Caponi, per la grande disponibilità mostrata, per le foto e la presentazione del set up operativo. Si ringrazia inoltre il dottor Bruno Checcucci, referente al trasferimento tecnologico dell’Istituto Nazionale di Fisica Nucleare (INFN) della sezione di Perugia, per l’organizzazione dell’incontro.
